生物分布

毒魚(yú)分布

在公元前2500年前的中國(guó)和埃及，人們就已知道有些鲀形目魚(yú)類(lèi)（河鲀）有毒，河鲀毒素之名，也因河鲀而起。而人們通常所指的河鲀（并非河豚）（puffer fish），為鲀科魚(yú)類(lèi)，泛指硬骨魚(yú)綱、鲀形目、鲀科的各屬魚(yú)類(lèi)，鲀科魚(yú)類(lèi)是最常見(jiàn)的含河鲀毒素的水產(chǎn)品。中國(guó)的鲀科魚(yú)類(lèi)共有54種，其中東方鲀屬22種。根據(jù)伍漢霖等調(diào)查，中國(guó)共有35種河鲀具有不同程度的河鲀毒性，其中，在中國(guó)南海分布的有24種，在中國(guó)東海包括臺(tái)灣沿海分布的有31種，在中國(guó)黃海分布的有14種，在中國(guó)渤海分布的有10種。少數(shù)種類(lèi)能洄游進(jìn)入江河，如暈環(huán)東方鲀（Takifugu coronoidus）、暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）、弓斑東方鲀（Takifugu ocellatus）、鉛點(diǎn)東方鲀（Fugu alboplumbeu）、兔頭鲀（Lagocephalus lagocephalus）、橫紋東方鲀（Takifuguoblongus）等。這些魚(yú)類(lèi)年產(chǎn)量約在3-4萬(wàn)噸，占世界河鲀總產(chǎn)量的70%左右。

在河鲀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)含河鲀毒素的器官或組織有肝臟、卵巢、皮膚、腸、肌肉、精巢、血液、膽囊和腎等，其中肝臟含河鲀毒素的河鲀有34種，卵巢含河鲀毒素的有32種，皮膚含河鲀毒素的有21種，腸含河鲀毒素的有21種，肌肉含河鲀毒素的有13種，精巢含河鲀毒素的有8種，血液含河鲀毒素的有4種，膽囊含河鲀毒素的有4種，腎含河鲀毒素的有1種。有些種類(lèi)的河鲀，地理分布不同，其體內(nèi)毒素分布的部位會(huì)也有所不同，如臺(tái)灣海域的紋腹叉鼻鲀（Arothron hispidus），其肌肉就有毒性了，而在南海海域，肌肉中則沒(méi)有河鲀毒素分布；又如東海南部的橫紋東方鲀（Takifugu oblongus），僅卵巢、肝臟和腸中含河鲀毒素，而在臺(tái)灣沿海的橫紋東方鲀，體內(nèi)河鲀毒素分布較為廣泛，在卵巢、肝臟、腸、膽囊、精巢、肌肉和皮膚中均有分布，不同河鲀的河鲀毒素分布器官或組織中的河鲀毒素量也不同。

程蘇云等調(diào)查了浙江沿海8種河鲀的毒性，菊黃東方鲀肝和皮膚有很強(qiáng)的毒性，均達(dá)到445鼠單位，而黃鰭東方鲀各部位的毒性均較低。暗紋東方鲀卵巢從III發(fā)育到Ⅵ期。卵巢的河鲀毒素含量不斷升高，在V期達(dá)到最高。然后下降。肝臟的河鲀毒素含量也不斷升高，但毒素含量增加不如卵巢明顯，在性腺發(fā)育各個(gè)時(shí)期，眼球、心臟、脾臟、胃腸、皮中的河鲀毒素含量沒(méi)有顯著提高。用河鲀毒素單抗檢測(cè)蟲(chóng)紋東方鲀（Takifugu vermicularis）的卵巢，發(fā)現(xiàn)河鲀毒素累積在卵母細(xì)胞的細(xì)胞核、卵黃囊和卵黃顆粒中，而在凹鼻鲀（Chelonodon patoca）的卵巢，河鲀毒素累積在卵巢的結(jié)締組織和卵母細(xì)胞的細(xì)胞核中，在蟲(chóng)紋東方鲀、凹鼻鲀和墨斑凹鼻鲀（Chelonodon nigroviridis）的皮膚中，發(fā)現(xiàn)河鲀毒素累積在腺體和粘液細(xì)胞中。

其他含毒生物

河鲀毒素及類(lèi)似物不僅存在于各種豚科魚(yú)中，還廣泛分布于各種高等、低等生物中，如云斑裸頰蝦虎魚(yú)（Yongeichthys criniger）、織紋螺（Nassarius spp.）等。Asakawa等首次報(bào)道牡蠣吊筏上的紐蟲(chóng)體內(nèi)含大量的河鲀毒素、4-表河鲀毒素、脫水河鲀毒素及3種未知毒素，最高毒性為14734MU/g。這種紐蟲(chóng)體質(zhì)量?jī)H為0.2-1.0 g，就足以殺死13000只小鼠。紐蟲(chóng)的毒性變化很大，認(rèn)為紐蟲(chóng)可能通過(guò)共生的微生物產(chǎn)生河鲀毒素或前體。而自1964年Mosher等首次在河鲀魚(yú)外的動(dòng)物蠑螈中發(fā)現(xiàn)河鲀毒素以來(lái)，人們對(duì)蠑螈體內(nèi)的河鲀毒素及其大量衍生物（1-Hydroxy-5，11-dideoxytetrodotoxin、6-表河鲀毒素）的研究興趣越來(lái)越濃，主要集中在闡述這種低等動(dòng)物的代謝途徑。從粗皮漬螈Taricha granulosa體內(nèi)分離出河鲀毒素的10，7內(nèi)酯型，該成分在河鲀毒素合成的第十五步環(huán)節(jié)中作為前體物質(zhì)，故研究蠑螈的代謝途徑將有助于更好地解釋河鲀毒素的起源。從亞歷山大藻培養(yǎng)液中檢出一定量的河鲀毒素，表明亞歷山大藻體內(nèi)麻痹性毒素和河鲀毒素同時(shí)存在。Kodama等認(rèn)為這種麻痹性貝毒的生產(chǎn)者—亞歷山大藻，可能是河鲀毒素的來(lái)源。即亞歷山大藻也是貝類(lèi)中河鲀毒素毒性的來(lái)源，當(dāng)亞歷山大藻大量繁殖時(shí)，貝類(lèi)體內(nèi)也積累著高含量的河鲀毒素。

其他含有河鲀毒素的生物有一個(gè)共同點(diǎn)，即其體內(nèi)含有多種能分泌毒素及其類(lèi)似物的細(xì)菌。已從海藻、花紋愛(ài)潔蟹（Atergatisfolridus）、多棘槭海星（Astropecten polyacanthus）、圓尾鱟（Carcinoscorpius rotundicauda）、蟲(chóng)紋東方鲀（Fugu vermicularis）和星點(diǎn)東方鲀（Takifugu niphobles）、腹足動(dòng)物（Niotha clethrate）、紐蟲(chóng)動(dòng)物中陸續(xù)分離到產(chǎn)TTX的細(xì)菌，淡水沉積物中也有此類(lèi)菌、海洋沉積物中分離的鏈霉菌（Streptomycessp.）能產(chǎn)TTX及其衍生物、海膽（Meoma ventricosa）中分離的致病菌VL21也被證實(shí)有產(chǎn)毒能力。產(chǎn)TTX的微生物類(lèi)群有弧菌屬（Vibrio）的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、希瓦氏菌屬的腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、交替單胞菌（Alteromonas）、芽孢桿菌（Bacillus）；放線(xiàn)菌屬的鏈霉菌（Streptomyces）。

物化性質(zhì)

化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)

河鲀毒素（tetradotoxin，簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)TX）系小分子量非蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素，中毒潛伏期短，死亡率高，毒素吸收后迅速作用于末梢神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使神經(jīng)傳導(dǎo)產(chǎn)生障礙，首先感覺(jué)神經(jīng)麻痹，而后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)麻痹，嚴(yán)重者腦干麻痹導(dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭。河鲀的表皮、內(nèi)臟、血液、睪丸、卵巢、肝、脾、眼球等不同組織中含有河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX），它是一種劇毒的非蛋白神經(jīng)毒素。其分子式為C11H17O8N3，分子量為319，該神經(jīng)毒素經(jīng)腹腔注射對(duì)小鼠的LD50為8μg/kg。TTX的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般烹調(diào)手段難以破壞。

河鲀毒素是一種重要的天然毒素。1909年日本學(xué)者田原純首先從河鲀魚(yú)中發(fā)現(xiàn)，并定名Tetrodotoxino 1950年-1957年間，橫尾晃、津田藤介等人首先從紅鰭東方鲀，紫色東方鲀卵巢中獨(dú)立地分離到了結(jié)晶態(tài)的河鲀毒素。其為無(wú)臭、易潮解的白色結(jié)晶體。該毒素結(jié)構(gòu)的測(cè)定由Woodward（哈佛大學(xué)）、平田和后藤（名古屋大學(xué)）及津田小組（東京大學(xué)一三共中央研究所）等分別完成。1964年在京都召開(kāi)的國(guó)際天然產(chǎn)物化學(xué)會(huì)議上同時(shí)報(bào)告了TTX的正確結(jié)構(gòu)，是一種分子量不大，但結(jié)構(gòu)很復(fù)雜的籠形原酸酯類(lèi)生物堿，分子中幾乎所有的碳原子均有不對(duì)稱(chēng)取代。因此它也被稱(chēng)為“自然界最奇特的分子之一”。

TTX是一種氨基全氫喹唑啉（Aminoperhydroquinazoline）型化合物，為白色結(jié)晶，無(wú)臭無(wú)味，微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑；對(duì)酸作用穩(wěn)定，對(duì)堿極不穩(wěn)定；沒(méi)有確定熔點(diǎn)，220℃以上炭化。TTX的結(jié)構(gòu)特征是有1個(gè)碳環(huán)，1個(gè)胍基，6個(gè)羥基，在C-5和C-10位有一個(gè)半醛糖內(nèi)酯連接著的分開(kāi)的環(huán)。在胰液酶、唾液淀粉酶、乳化酶、糖轉(zhuǎn)化酶等酶類(lèi)存在下不分解。只溶于酸性水或醇溶液，在堿水溶液中易分解，在5%氫氧化鉀溶液中于90-100℃下可分解成黃色結(jié)晶2-氨基-羥甲基-8-羥基-喹唑啉。它是相當(dāng)特殊的一種有機(jī)化合物，分子內(nèi)的胍基與氮原子是質(zhì)子化的，正羰酸也離解為陰離子，所以河鲀毒素是以?xún)?nèi)鹽形式存在。在室溫下用50 g/L的氫氧化鋇處理河鲀毒素可得脫水河鲀毒素—由pKa1值為2.5的羧基和pKa2值為10.9的胍基組成的兩性離子化合物，其可在水中與一分子的溴完全反應(yīng)產(chǎn)生河鲀酸。河鲀毒素在酸中也能部分異構(gòu)化為脫水表河鲀毒素，從而影響對(duì)河鲀毒素的提取純度。所以，河鲀毒素制劑經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間放置可降解。至于河鲀酸是否具備毒性尚有爭(zhēng)議。因此，在生物代謝過(guò)程中，脫水和脫氧過(guò)程會(huì)降低毒性，而加氧機(jī)制能夠使毒性增強(qiáng)。

在河鲀魚(yú)中，河鲀毒素與其同系物是同時(shí)存在的。河鲀毒素的同系物種類(lèi)較多，從河鲀、紐蟲(chóng)、兩棲類(lèi)等生物體內(nèi)分離得到的同系物包括：4-epiTTX，6-epiTTX，11-deoxyTTX，11-deoxy-4-epiTTX，11-norTTX-6（R）-ol，11-norTTX-6（S）-ol，11-norTTX-6,6-diol，4,9-anhydroTTX，11-oxoTTX，4,9-anhydro-4-epiTTX，4,9-anhydro-11-deoxyTTX，5-deoxyTTX，tetrodonicacid，4，9-anhydro-6-epi-TTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX等。這些同系物可能與河鲀毒素的代謝或生物合成有關(guān)。在河鲀毒素的同系物中，5-deoxyTTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX、4,9-anhydroTTX、4,9-anhydro-6-epi-TTX、河鲀酸等同系物的毒性較低，甚至無(wú)毒，而11-oxoTTX雖比較罕見(jiàn)，其毒性卻是TTX的4-5倍。它們與河鲀毒素性質(zhì)相似，有一定的生理活性，如：河鲀毒素的小鼠LD50為10μg/kg，6-表河鲀毒素為60μg/kg，11-去氧河鲀毒素為71μg/kg。 

提取與精制

TTX具有鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的功效。對(duì)河鲀毒素的提取分離研究首先是晶化問(wèn)題。自從田原于1909年首次分離到TTX的粗素以來(lái)，經(jīng)過(guò)了40年，直到橫尾（1950）、津田（1952）、荒川（1956）、平田（1957）等人，才分離出TTX結(jié)晶，其分離方法分別為：橫尾法（氧化鋁柱層析），津田—河村法（圓形濾紙層析法），津田—河村大規(guī)模生產(chǎn)法（活性炭層析法），平田—后藤法（離子交換樹(shù)脂—活性炭吸附法）等。通常TTX的提取步驟是：河鲀卵巢—水提取—除蛋白質(zhì)—離子交換—脫色—活性炭吸附—濃縮—精制—結(jié)晶?，F(xiàn)代分離河毒素多采用層析法，其具體方法如下：首先，把富含毒素的樣品絞碎，與含1%醋酸的甲醇液一起勻漿以抽提河毒素，勻漿液經(jīng)5000-6000r/min，離心10-15min，沉淀物再用以上方法重復(fù)兩次。合并上清液，減壓濃縮，并用氯仿除去脂肪。之后經(jīng)過(guò)冷凍干燥或再減壓濃縮，濃縮液經(jīng)Bio-Gel-P2或CM-Sephadex C-25（NH4 ）或Amberlite IRC-50（NH4 ）層析，用0.1-0.4 mol/L醋酸洗脫，合并有毒成分，濃縮后再經(jīng)Bio-Rex70（H ）層析，以0.1-0.3mol/L醋酸洗脫，然后再重復(fù)一次，Bio-Rex70（H ）柱層硒，即可得到純度非常高的樣品。

日本人田原最早制得的TTX，純度只有0.2%，半數(shù)致死量LD50為4.1mg/kg；橫尾用磷鎢酸、苦味酸汞、苯肼、苦味酸汞和苦酮酸等依次處理，得到的粗毒素的LD50為800μg/kg；此后，橫尾又采用氧化鋁柱直接過(guò)濾的方法制備，得到的TTX的LD50為13μg/kg。中國(guó)于1958年開(kāi)始進(jìn)行TTX的提取分離工作。陳成添等采用熱甲醇法、微火煮沸法、沸水浴法對(duì)河鲀混合卵和混合肝的毒素進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，用這三種方法提取的混合卵毒力的均值分別為：熱甲醇法1524，微火煮沸法2518，沸水浴法2491。微火煮沸法和沸水浴法提取效果較佳，熱甲醇法較差。楊春等以含毒量低的棕斑腹刺鲀?yōu)閷?duì)象，研究以甲醇、乙醇、乙酸、水等4種溶劑提取TTX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸的提取效果最好。林文鑾等提出用甲醇乙酸法提取TTX較完全，以活性炭脫色純化的效果最好，但毒力有一定的損失。李世平等以離心法取代傳統(tǒng)過(guò)濾法，并用減壓濃縮法去除提取液中的乙醚，改進(jìn)了乙酸提取法，提高了得率。TTX的分離和提取大多采用離子交換、活性炭柱層析及凝膠柱層析、吸附樹(shù)脂等方法。津田一河村用活性炭層析，采用以甲醇提取的浸膏上活性碳柱，以0.8%醋酸-10%甲醇-水洗脫，粗結(jié)晶溶于醋酸，加入氨水，低溫下重結(jié)晶，1000kg卵巢中可獲得10gTTX。郭慧清等聯(lián)合采用吸附樹(shù)脂D D101與弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂D152提取河鲀毒素，改進(jìn)了除蛋白質(zhì)的方法。國(guó)海洋大學(xué)的崔建洲等利用D201大孔樹(shù)脂層析、超濾、離子交換層析、分子篩層析、反相制備液相色譜等方法，從假睛東方鲀的肝臟中分離純化得到TTX晶體，得率為81.1%。另外，中國(guó)國(guó)家海洋局第三研究所采用多重膜分離提取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法制備河鲀毒素純品，純度可達(dá)99.0%以上。

苦味酸鹽法的氨解也可制備TTX純品，其步驟如下：將粗品毒素（3.2g）和苦味酸（2.3g）溶于29 ml沸水之中，趁熱過(guò)濾。冷卻濾液，分離結(jié)晶沉淀，此沉淀在熱水中重結(jié)晶3次，得黃色針狀結(jié)晶的TTX苦味酸鹽（4.8g）。此鹽在200℃以上變黑，但不溶。元素分析樣品需于80-100℃真空干燥20h。用4.7g苦味酸鹽在熱水中溶解，以氨水調(diào)節(jié)pH至9，冷卻后，過(guò)濾出沉淀固體并加水洗滌。再溶于少量稀醋酸，加入氨水再沉淀，可得到純TTX 2.6g。

根據(jù)河鲀毒素的微生物起源，分離出產(chǎn)河鲀毒素的微生物類(lèi)群，通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生河鲀毒素。產(chǎn)TTX 的微生物類(lèi)群有弧菌屬（Vibrio）的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum），假單胞菌屬（Pseudomonas），希瓦氏菌屬的腐敗希瓦菌（Shewanella putrefy aciens），交替單胞菌（Alteromonas），芽孢桿菌屬（Bacillus），鏈霉菌屬（Streptomyces），其中產(chǎn)毒力較高的主要是溶藻弧菌和河鲀毒素互生單胞菌（Alteromonas tetrodonis）。但微生物產(chǎn)河鲀毒素產(chǎn)量非常低，僅為ng級(jí)。其產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚。

毒理

作用機(jī)制

1982年，美國(guó)植物學(xué)家韋德-戴維斯發(fā)現(xiàn)，海地巫毒教中的回魂大師在藥物中使用含有從河鲀提取的毒素粉末，整個(gè)過(guò)程里中毒者大腦能完全保持清醒，如果能挺過(guò)24h，他們就會(huì)很快恢復(fù)正常，且不會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥。使人們相信他們有使人“死而后生”的能力，即所謂的“還魂術(shù)”。其實(shí)，這是由于河鲀毒素的特殊結(jié)構(gòu)使其像塞子一樣，凝固在神經(jīng)軸突的鈉離子通道的入口處，阻礙鈉離子透過(guò)細(xì)胞膜傳導(dǎo)神經(jīng)的沖動(dòng)，從而關(guān)閉神經(jīng)系統(tǒng)。由于河鲀毒素不能越過(guò)大腦中血液細(xì)胞的屏障，因此受害者就會(huì)處于大腦清醒的無(wú)助狀態(tài)之中。幾小時(shí)或幾天過(guò)后，當(dāng)河鲀毒素最終開(kāi)放鈉離子通道時(shí)大多數(shù)受害者已經(jīng)死亡。

TTX是典型的鈉離子通道阻斷劑，它能選擇性與肌肉、神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的鈉離子通道受體結(jié)合，阻斷電壓依賴(lài)性鈉離子通道，從而阻滯動(dòng)物電位，抑制神經(jīng)肌肉間興奮的傳導(dǎo)，導(dǎo)致與之相關(guān)的生理機(jī)能的障礙，主要造成肌肉和神經(jīng)的麻痹。構(gòu)效關(guān)系表明，TTX的活性基團(tuán)是1，2，3 位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10 位的羥基，胍基在生理pH值下發(fā)生質(zhì)子化，形成正電活性區(qū)域與鈉離子通道受體蛋白的負(fù)電性羰基相互作用，從而阻礙離子進(jìn)入通道。鈉離子受體至少有6個(gè)特異性靶分子結(jié)合位點(diǎn)，TTX是與鈉通道受體部位I結(jié)合。TTX受體位于可興奮細(xì)胞膜外側(cè)、鈉通道外口附近，TTX與受體部位結(jié)合，阻礙鈉離子接近通道外口。研究表明，TTX特異性作用于鈉通道，對(duì)鉀、鈣通道和神經(jīng)肌肉的突觸及膽堿指酶無(wú)直接影響。此外，毒素能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞，對(duì)中樞產(chǎn)生明顯的抑制作用?？偟膩?lái)說(shuō)，TTX對(duì)呼吸和心血管的抑制是對(duì)中樞和外周的共同作用結(jié)果。

河鲀毒素毒理作用的主要表征是阻遏神經(jīng)和肌肉的傳導(dǎo)。除直接作用于胃腸道引起局部刺激癥狀外，河鲀毒素被機(jī)體吸收進(jìn)入血液后，能迅速使神經(jīng)末梢和神經(jīng)中樞發(fā)生麻痹，繼而使得各隨意肌的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)麻痹；毒量增大時(shí)會(huì)毒及迷走神經(jīng)，影響呼吸，造成脈搏遲緩；嚴(yán)重時(shí)體溫和血壓下降，最后導(dǎo)致血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和呼吸神經(jīng)中樞麻痹而迅速死亡。TTX可選擇性地抑制可興奮膜的電壓，阻礙Na 通道的開(kāi)放，從而阻止神經(jīng)沖動(dòng)的發(fā)生和傳導(dǎo)，使神經(jīng)肌肉喪失興奮性。此后，多數(shù)研究工作都是圍繞著TTX阻斷可興奮組織的Na 通道而展開(kāi)。河鲀對(duì)TTX具有抵抗力和免疫性。如果該區(qū)域出現(xiàn)由芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的氨基酸置換，就會(huì)顯著影響它與TTX結(jié)合的靈敏度。在對(duì)河鲀毒素沒(méi)有免疫力的生物體內(nèi)，鈉通道的α-亞基上存在河鲀毒素的受體，河鲀毒素與α-亞基門(mén)孔附近的氨基酸殘基結(jié)合，阻止鈉離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起河鲀毒素中毒。而河鲀體內(nèi)細(xì)胞的構(gòu)造與其他生物不同，河鲀體內(nèi)還存在可以與河鲀毒素結(jié)合的其他蛋白質(zhì)，從而使河鲀對(duì)體內(nèi)的河鲀毒素具有免疫力。比較紅鰭東方鲀（Fugu rubripes）、黑青斑東方鲀（Tetraodon nigroviridis）和斑馬魚(yú)的基因序列圖譜，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀和黑青斑東方鲀骨骼肌的Nav1.4通道發(fā)生了變異，正是這種變異使河鲀具有抵抗河鲀毒素的能力。紅鰭東方鲀和豹紋東方鲀的變異類(lèi)似，都是在Nav1.4通道的401位點(diǎn)上發(fā)生了取代，取代為一個(gè)折疊程度更高的不飽和氨基酸。河鲀的這些氨基酸是不與河鲀毒素結(jié)合的，從而也就不能對(duì)河鲀的鈉通道造成影響。通過(guò)克隆調(diào)控豹紋東方鲀骨骼肌Nav1.4通道表達(dá)的cDNA，發(fā)現(xiàn)Nav1.4通道區(qū)域Ⅰ401位點(diǎn)處存在一個(gè)不飽和氨基酸，即天冬酰胺。通過(guò)基因工程把不飽和氨基酸移植到對(duì)河鲀毒素敏感的小鼠骨骼肌Nav1.4通道處，移植的不飽和氨基酸的折疊程度越高，小鼠抵抗河鲀毒素的能力越強(qiáng)。當(dāng)不飽和氨基酸的折疊程度大于取代位點(diǎn)氨基酸折疊程度的2500倍時(shí)，IC50（50%Na 通道發(fā)生阻斷時(shí)河鲀毒素的濃度）提高至47μmol/L。

一些生物對(duì)河鲀毒素的耐受性與其獨(dú)特的鈉離子通道結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，3×10^-6M的河鲀毒素對(duì)Arothron hispidus等7種河鲀魚(yú)肌肉的動(dòng)作電位沒(méi)有影響，而3×10^-7M的河鲀毒素卻阻斷了3種不含河鲀毒素的其他魚(yú)的動(dòng)作電位。河鲀毒素的結(jié)合位點(diǎn)位于鈉離子通道內(nèi)高度保守的成孔區(qū)域（P-loop），對(duì)河鲀毒素敏感的鈉離子通道（TTX-sensitiveNa channel）在該區(qū)域有與TTX高度親和的芳香性氨基酸。如果該區(qū)出現(xiàn)由芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的氨基酸置換，就會(huì)顯著影響其與TTX結(jié)合的靈敏度，從而使鈉離子通道成為抗河鲀毒素的鈉離子通道（TTX-resistantNa channel）。通過(guò)對(duì)河鲀魚(yú)（Fugu pardalis）骨骼肌Nav1.4通道的cDNA基因序列圖譜的研究發(fā)現(xiàn)，通道的結(jié)構(gòu)域I的成孔區(qū)域的401位置包含有一個(gè)非芳香氨基酸，即天冬酰胺酸，而此位點(diǎn)發(fā)生的氨基酸置換可能與河鲀魚(yú)對(duì)高濃度的TTX耐受有關(guān)。在捕食與防御的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，在北美西部，一些束帶蛇對(duì)河鲀毒素也具備了一定的耐受力，而且，不同地區(qū)的束帶蛇對(duì)河鲀毒素的耐受力也有明顯差異。對(duì)這些束帶蛇的Nav1.4通道進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，他們的芳香氨基酸在401位點(diǎn)是保守的，但在結(jié)構(gòu)域IV的成孔區(qū)域發(fā)生了幾處氨基酸置換。在WillowCreek地區(qū)的束帶蛇的Nav1.4通道的結(jié)構(gòu)域IV包含有3個(gè)氨基酸的置換，該地區(qū)束帶蛇對(duì)TTX的耐受力比Benton地區(qū)的高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，因?yàn)楹笳咧话?個(gè)氨基酸替代。只在河鲀魚(yú)與束帶蛇中發(fā)現(xiàn)它們對(duì)河鲀毒素的耐受性與其骨骼肌和神經(jīng)元的鈉離子通道發(fā)生了氨基酸替代有關(guān)。這兩種生物之間的一個(gè)主要差別就是，幾乎所有的河鲀魚(yú)對(duì)TTX都有一定的耐受性，而且有相同耐受機(jī)制，但是只有一部分束帶蛇具有對(duì)TTX的耐受力。

毒素起源

起源內(nèi)因說(shuō)

主張內(nèi)因說(shuō)的學(xué)者認(rèn)為，河鲀等生物體含有的刺胞、毒腺中的蛋白質(zhì)毒素是內(nèi)源性毒素的來(lái)源。他們推測(cè)河鲀魚(yú)體內(nèi)有特定功能或微生物，能將攝入的食物轉(zhuǎn)化為毒素。但始終沒(méi)有更多證據(jù)證實(shí)這種說(shuō)法，因此內(nèi)因說(shuō)沒(méi)有得到廣泛認(rèn)可。不少研究者認(rèn)為，許多海洋細(xì)菌能產(chǎn)生河鲀毒素，作為河鲀魚(yú)類(lèi)食物的一些動(dòng)物，如海星等也含有河鲀毒素，而人工飼養(yǎng)的河鲀卻沒(méi)有河鲀毒素，表明河鲀本身并無(wú)產(chǎn)生TTX的能力。但后來(lái)河鲀毒素由細(xì)菌產(chǎn)生的觀點(diǎn)遭到了反駁，Kmatsumura在1995年就發(fā)現(xiàn)從解藻朊酸弧菌（Vibrio alginolyiicus）中提取出來(lái)的河鲀毒素并沒(méi)有與河鲀毒素的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，認(rèn)為生物鑒定法存在弊端，因此有必要重新認(rèn)識(shí)“TTX是由細(xì)菌產(chǎn)生的”這一觀點(diǎn)。為了證實(shí)產(chǎn)生河鲀毒素的原因是內(nèi)源性的，Kendo于1998年提取了星點(diǎn)東方鲀成熟的卵細(xì)胞進(jìn)行人工授精及胚胎培育，發(fā)現(xiàn)在孵化過(guò)程中胚胎體內(nèi)河鲀毒素的含量一直在增加。這表明增加的毒素是胚胎的產(chǎn)物。由此可知，河鲀體內(nèi)的TTX可能并非直接來(lái)源于細(xì)菌，而是河鲀本身與其體內(nèi)共生細(xì)菌共同的產(chǎn)物。河鲀等動(dòng)物自身是否具有分泌毒素的功能，以及河鲀毒素如何在機(jī)體各器官內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移等，還有待進(jìn)一步研究。

而且，河鲀毒素在河鲀之外的物種分布，和河鲀體內(nèi)細(xì)菌能分泌河鲀毒素等現(xiàn)象，不能說(shuō)明河鲀本身不能產(chǎn)生河鲀毒素。Matsumura就對(duì)河鲀毒素的細(xì)菌起源提出了質(zhì)疑，他發(fā)現(xiàn)弧菌（Vibrioalginolyticus）所產(chǎn)的河鲀毒素并不能和河鲀毒素的單克隆抗體反應(yīng)，說(shuō)明細(xì)菌產(chǎn)生的河鲀毒素與河鲀體內(nèi)的河鲀毒素并不完全相同。 但細(xì)菌產(chǎn)生的河鲀毒素同樣能使小鼠致死，說(shuō)明其可能是河鲀毒素的衍生物。但是，內(nèi)源假說(shuō)同樣不能解釋一些事實(shí)，僅在投喂配合飼料的條件下，人工養(yǎng)殖的河鲀體內(nèi)的河鲀毒素沒(méi)有或含量很低，此事實(shí)很難用內(nèi)源假說(shuō)來(lái)解釋。Matsui等認(rèn)為河鲀體內(nèi)有一種能夠儲(chǔ)藏TTX的機(jī)制。但是，如果河鲀僅僅能儲(chǔ)藏河鲀毒素，同樣也難以解釋胚胎發(fā)育過(guò)程中河鲀毒素含量一直在增加的現(xiàn)象。因此，河鲀體內(nèi)的河鲀毒素極有可能是河鲀與其體內(nèi)共生細(xì)菌共同的產(chǎn)物，體內(nèi)共生細(xì)菌產(chǎn)生河鲀毒素的衍生物，河鲀把此衍生物轉(zhuǎn)化為河鲀自身的河鲀毒素。河鲀胚胎發(fā)育過(guò)程中河鲀毒素含量一直在增加，可能是共生細(xì)菌產(chǎn)生的河鲀毒素衍生物，在卵子受精前就已經(jīng)累積在卵中，受精后的胚胎發(fā)育過(guò)程中，河鲀胚胎逐漸具備把此衍生物轉(zhuǎn)化為自身河鲀毒素的能力。因此，胚胎發(fā)育過(guò)程中河鲀毒素含量可持續(xù)增加。

外因說(shuō)

在Mosher等從加州蠑螈（Tarichatorosa）中分離到河鲀毒素以前，河鲀毒素一直被認(rèn)為是河鲀產(chǎn)生的，之后，在蝦虎魚(yú)、蛙類(lèi)、馬蹄蟹、海星、紐蟲(chóng)、箭蟲(chóng)、環(huán)節(jié)動(dòng)物、石灰質(zhì)藻類(lèi)等中均分離到河鲀毒素，使人們相信河鲀毒素的分布比較廣泛。1986年，Noguchi等首次報(bào)道了從花紋愛(ài)潔蟹（Atergatisfloridus）的腸道內(nèi)分離到一種產(chǎn)河鲀毒素的細(xì)菌，1987年，Noguchi等從蟲(chóng)紋東方鲀腸道中也分離出能產(chǎn)河鲀毒素的細(xì)菌Vibrio alginolyticus，此后，從各種動(dòng)物的多種動(dòng)物體內(nèi)或體表、海洋沉積物、淡水沉積物中也分離到了產(chǎn)河鲀毒素及其衍生物的各種微生物，這些發(fā)現(xiàn)，使人們更加相信河鲀體內(nèi)河鲀毒素的體外起源假說(shuō)，日本的清水、松居是最早提出“外因說(shuō)”的學(xué)者。他們用含TTX的餌料飼喂人工養(yǎng)殖的無(wú)毒河鲀及人工采苗后飼養(yǎng)的河鲀，結(jié)果這些無(wú)毒河鲀發(fā)生毒化現(xiàn)象。由此推測(cè)，毒素的起源可能是外因性的。該假說(shuō)認(rèn)為河鲀體內(nèi)河鲀毒素來(lái)源于環(huán)境中的河鲀毒素或產(chǎn)河鲀毒素的細(xì)菌。

Noguchi等采用小鼠和液相-質(zhì)譜技術(shù)調(diào)查了日本1990到2003期間在離開(kāi)海底10米以上的網(wǎng)箱養(yǎng)殖紅鰭東方鲀的河鲀毒素毒性情況，在肝臟、皮膚、肌肉、性腺中均沒(méi)有檢測(cè)到河鲀毒素（檢測(cè)靈敏度<0.1MU/g），表明喂養(yǎng)人工配合飼料的紅鰭東方鲀沒(méi)有毒性，說(shuō)明可以通過(guò)遠(yuǎn)離海底沉積物能有效培養(yǎng)無(wú)毒的紅鰭東方鲀。而Hwang等發(fā)現(xiàn)，不同水質(zhì)對(duì)人工養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀的毒性往往是有影響的，在臺(tái)北宜蘭縣兩個(gè)養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀是無(wú)毒的，而在毗鄰的臺(tái)北縣養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀的卵巢在1-3月是有毒的，肝臟在1-3月是有弱毒的。江蘇宜興人工養(yǎng)殖的暗紋東方鲀所有受檢的器官組織均是無(wú)毒的。采用投喂配合飼料和在淡水環(huán)境養(yǎng)殖暗紋東方鲀，其1-3齡均為無(wú)毒或低毒。華元渝等采用高效液相色譜儀和熒光分光光度計(jì)聯(lián)合法隨機(jī)抽樣檢驗(yàn)經(jīng)過(guò)純?nèi)斯し敝场⒚绶N培育至商品魚(yú)的暗紋東方鲀毒性，結(jié)果表明其體內(nèi)4種組織器官中的河鲀毒素平均含量低于2μg/g，屬基本無(wú)毒。

Nagashima等提出河鲀體內(nèi)的毒素是通過(guò)食物鏈富集的，河鲀肝臟的薄切片吸收河鲀毒素的能力比其他魚(yú)類(lèi)肝臟的薄切片要強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)也證明，人工養(yǎng)殖的河鲀不含河鲀毒素，但是在飼料中添加有毒河鲀的肝臟，養(yǎng)殖河鲀體內(nèi)就含有河鲀毒素。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為河鲀體內(nèi)的河鲀毒素是受食物鏈和微生物雙重影響的結(jié)果。

在河鲀毒素起源方面研究得最多的是東方鲀。一般認(rèn)為，降海洄游的河鲀產(chǎn)生河鲀毒素的可能性有以下幾種：（1）東方鲀下海后在海水環(huán)境中自身產(chǎn)生TTX；（2）海水中某些生物含有TTX，被河鲀吞食后吸收并儲(chǔ)藏、濃集于體內(nèi)；（3）許多海洋生物的代謝產(chǎn)物中含有TTX。從研究來(lái)看，河鲀自身產(chǎn)生河鲀毒素的可能性不大，因?yàn)槌撕喻兺?，海洋中還有許多河鲀喜食的生物體內(nèi)都含有TTX。另外，生存于淡水中未經(jīng)降海洄游的河鲀體內(nèi)檢不出TTX，也說(shuō)明河鲀自身不產(chǎn)毒。但在投喂含TTX的飼料一段時(shí)間后，其體內(nèi)又能檢出TTX。因此，TTX很有可能是通過(guò)食物鏈在河鲀體內(nèi)聚集的。而且，海洋中許多含毒細(xì)菌黏附于河鲀喜食的生物體表，進(jìn)入河鲀體內(nèi)后就與其形成互利共生的關(guān)系，河鲀可通過(guò)皮膚腺的暴露來(lái)釋放TTX，從而起到抵御天敵的作用。

Noguchi等在對(duì)麻痹性貝毒導(dǎo)致蟹類(lèi)毒化的機(jī)制的追蹤過(guò)程中，從石灰藻及毒蟹內(nèi)臟中分離到了可產(chǎn)生毒素的細(xì)菌，經(jīng)鑒定，它們是假單胞菌屬（Pseudomonassp.）細(xì)菌。從該菌培養(yǎng)液中得到的兩種毒素，經(jīng)FLD-HPLC法及紅外光譜、質(zhì)譜分析法分析，確證為T(mén)TX及脫水TTX。進(jìn)一步將其分別注射入小鼠腹腔，顯示了與TTX和脫水-TTX相對(duì)應(yīng)的致死率，從而確證TTX為細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。Thuesen等從4種毛顎動(dòng)物（Chaetognatha）體內(nèi)分離到34株弧菌屬（Vibriosp.）海洋細(xì)菌，其培養(yǎng)物和胞外產(chǎn)物均可阻斷Na 通道。經(jīng)組織培養(yǎng)法及液相色譜等方法同樣確證該產(chǎn)物為T(mén)TX。由此可見(jiàn)，產(chǎn)TTX的細(xì)菌是多樣性的。吳韶菊等通過(guò)分離和篩選河鲀各個(gè)器官內(nèi)的細(xì)菌，從36種細(xì)菌中挑選出了20種能分泌TTX的細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)卵巢和肝臟中TTX的含量高，其內(nèi)部所含的菌株數(shù)量和毒性也都比其他組織高，從而說(shuō)明河鲀所含的TTX與其共生細(xì)菌密切相關(guān)。

河鲀毒素的“體外起源”假說(shuō)假定所有能產(chǎn)生TTX的生物都與其體內(nèi)能分泌TTX的微生物有著密切聯(lián)系，并且已被隨后從各種攜帶TTX的生物體內(nèi)提取出來(lái)的能產(chǎn)生TTX的細(xì)菌所證實(shí)。另外，TTX的累積機(jī)制不僅可通過(guò)食物鏈獲得，也能由其自身腸道內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)生，因?yàn)楹Ｑ笾杏行┥镆矓z食與河鲀同樣的食物，但它們的體內(nèi)并不含有TTX，從而估計(jì)河鲀體內(nèi)有一種能夠儲(chǔ)藏TTX的機(jī)制。大多數(shù)研究者都認(rèn)為，河鲀體內(nèi)的TTX是受食物鏈和微生物雙重影響的結(jié)果。

河鲀體內(nèi)TTX的含量不僅存在個(gè)體間的差異，并且其體內(nèi)各組織中TTX的含量也存在明顯的差異。一般卵巢和肝臟中含量最多，精巢次之，皮膚和肌肉中則是微量或沒(méi)有。Yuji等將河鲀的肝臟組織培養(yǎng)在含TTX的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)它能吸收TTX，證明河鲀肝臟并不能分泌TTX，而是吸收體外的TTX。這也進(jìn)一步證明了河鲀體內(nèi)的TTX是外源性的。

其他學(xué)說(shuō)

有學(xué)者從免疫學(xué)的角度對(duì)河鲀富集河鲀毒素的機(jī)制進(jìn)行了解釋。用河鲀毒素做生物免疫實(shí)驗(yàn)，用相同濃度的河鲀毒素微量注射于有毒河鲀、無(wú)毒河鲀和小鼠體內(nèi)做毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有毒河鲀對(duì)河鲀毒素的免疫耐受能力最強(qiáng)，無(wú)毒河鲀的免疫耐受能力比小鼠的強(qiáng)。由此推斷，有毒河鲀對(duì)河鲀毒素具有特殊的免疫耐受調(diào)控機(jī)制。也有學(xué)者從分子生物學(xué)角度進(jìn)行了論證。Yotsu-YamashitaM等研究認(rèn)為，在河鲀體內(nèi)存在一種蛋白質(zhì)，可與河鲀毒素聯(lián)結(jié)形成復(fù)合物，Matsui等也已經(jīng)從星點(diǎn)東方鲀中提取出了河鲀毒素與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)形成的復(fù)合物。Jeen等從河鲀肝臟內(nèi)提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過(guò)cDNA末端擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)cDNA中纖維蛋白原基因（flp）的含量與河鲀毒素的毒力水平呈線(xiàn)性關(guān)系。由此可以推斷，河鲀體內(nèi)的河鲀毒素是與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)在一起以復(fù)合物的形式存在，并且河鲀毒素的含量是受基因調(diào)控的。人們對(duì)河鲀富集河鲀毒素的機(jī)理從不同的角度進(jìn)行了論證，但沒(méi)有形成統(tǒng)一的觀點(diǎn)。不過(guò)養(yǎng)殖的河鲀毒性較低，這為開(kāi)放河鲀魚(yú)市場(chǎng)提供了理論依據(jù)。

檢測(cè)方法

河純毒素在發(fā)現(xiàn)之初人們就在不斷尋找其更好的檢測(cè)方法。河鲀毒素檢測(cè)常用的方法有小鼠檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、柱后衍生高效液相色譜檢測(cè)法、氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用等。國(guó)外較多地采用氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用的方法檢測(cè)河鲀毒素。

小鼠生物法（以30分鐘內(nèi)將一體重20克小鼠致死所用河純毒素的量為一鼠單位）是最常用、最直觀的檢測(cè)方法，通過(guò)小鼠死亡前所呈現(xiàn)出的典型的河鲀毒素中毒癥狀，可迅速地將河鲀毒素與其它致死性物質(zhì)區(qū)分開(kāi)。最早對(duì)河毒素進(jìn)行定量分析研究是在1941年，當(dāng)時(shí)斯坦福大學(xué)在研究蠑螈毒素時(shí)引進(jìn)了鼠單位（Mouse unit，MU）概念。其原理是，一定體重的小鼠經(jīng)腹腔注射TTX后，其死亡時(shí)間的倒數(shù)與注射TTX劑量之間存在著線(xiàn)性關(guān)系，因此可根據(jù)小鼠死亡時(shí)間推斷TTX的含量。此法測(cè)得的毒力用小鼠單位（mouse unit，MU）表示。黃登福等采用同樣的方法，使用ICR品系小鼠建立了測(cè)試TTX毒素的方法，1MU=0.178μgTTX。但實(shí)際使用時(shí)因個(gè)體差異大、重現(xiàn)性不好，而且需有一定規(guī)模才能客觀反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此該法的應(yīng)用受到限制。 

免疫酶技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的新的免疫測(cè)定法，它是抗原抗體的免疫反應(yīng)與酶的高效催化作用原理的有機(jī)結(jié)合。Watabe等首先于1989年建立了用牛血清白蛋白（BSA）連接河鲀酸（TDA）作為抗原的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）法，檢出限為0.3-1000.0mg/L。李世平等應(yīng)用小鼠生物試驗(yàn)和間接競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）同步檢測(cè)17份河鲀肝組織和20份河鲀肌肉組織中的河鲀毒素含量，并對(duì)2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，ELISA法與小鼠生物試驗(yàn)法測(cè)得的結(jié)果相符合。由于ELISA法測(cè)定程序簡(jiǎn)便易行，速度快，靈敏度高，因而在河鲀毒素的定量檢測(cè)以及預(yù)防河鲀中毒方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

高效液相色譜是分析、制備領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛也最為成熟的技術(shù)之一，它具有分離效率高、分辨率好及速度快等特點(diǎn)。張虹等采用醋酸與TTX結(jié)合形成離子對(duì)在ODS柱上采用紫外檢測(cè)器直接測(cè)定TTX含量，該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，最低檢測(cè)限50ng。王小逸等還利用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行TTX測(cè)定，該法可用于微克水平河鲀毒素含量的測(cè)定。劉海新等采用柱后衍生高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中的河鲀毒素含量，樣品先由0.1%乙酸提取，再經(jīng)過(guò)C18固相萃取柱凈化。以庚烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑，應(yīng)用反相離子對(duì)液相色譜分離河鲀毒素，采用在線(xiàn)柱后衍生系統(tǒng)，熒光檢測(cè)器定量檢測(cè)。河鲀毒素在5-1600ng的范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.9997；1、2、8μg/g，3個(gè)濃度水平添加樣，日內(nèi)和日間的回收率為80.9-91.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.93% -5.57%；方法定量限為1μg/g。高效液相色譜熒光檢測(cè)器要比紫外檢測(cè)器具有更低的檢測(cè)限，而TTX沒(méi)有熒光吸收，所以必須先要衍生化成具有熒光吸收的物質(zhì)，操作比較繁瑣。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜所具有的超強(qiáng)定性能力使色譜質(zhì)譜聯(lián)用成為分析行業(yè)最有效最準(zhǔn)確的分析方法之一。1993年SaitoT利用氣-質(zhì)聯(lián)用從刀魚(yú)中檢測(cè)到TTX及其同分異構(gòu)體的存在。Nagashima等利用氣-質(zhì)聯(lián)用從暗紋東方鲀肝臟含有的高分子物質(zhì)中檢測(cè)到河鲀毒素的存在。吳平谷等用2%乙酸/甲醇提取出河鲀毒素，用正己烷脫脂，然后用堿將河鲀毒素水解成2-氨基-8-羥基-6-羥甲基-喹唑啉（C9堿），水解液經(jīng)過(guò)C18、SLH固相萃取柱凈化，BSTFA衍生，采用氣相色譜—質(zhì)譜法全掃描方式測(cè)定。液相色譜質(zhì)譜法比氣相色譜質(zhì)譜法具有更廣的應(yīng)用范圍，不需要衍生化，大大簡(jiǎn)化了分析手段。Tsai等采用了液相/質(zhì)譜聯(lián)用法來(lái)測(cè)定河鲀中的TTX。李?lèi)?ài)峰等應(yīng)用C18反相色譜柱和HILIC親水作用色譜柱，建立了河鲀毒素（TTX）的液相色譜—電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。鄭雍怡等建立了在大鼠腹腔注射給藥后，測(cè)定其血漿中河鲀毒素的高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）定量檢測(cè)方法。王洪允等建立了LC-MS-MS測(cè)定血漿中河鲀毒素的檢測(cè)方法，其檢測(cè)限濃度為1ng/mL。

熒光法是最早建立的定量檢測(cè)TTX的儀器分析方法。1976年，Saito等首先提出了熒光法，原理是加堿水解后生成2-氨基6-羥甲基8-羥基喹唑啉（簡(jiǎn)稱(chēng)C9堿），該物質(zhì)發(fā)熒光，建立了最早的熒光分析法；其后，又有研究對(duì)熒光檢測(cè)法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了連續(xù)自動(dòng)熒光分析方法。陳玉仁等建立了紫外分光光度法。該法與熒光法相比，二者最低檢出限接近，但后者儀器設(shè)備較便宜。

Nagashima等建立了薄層色譜快原子轟擊質(zhì)譜的測(cè)定方法。先在LHP-K板上進(jìn)行TLC，純化TTX及其衍生物，然后用質(zhì)譜定量，最低檢出限為0.1g。此法可以區(qū)分在其它TLC方法中難以區(qū)分的TTX和脫水TTX，其優(yōu)點(diǎn)還在于不需TMS硅烷化，甚至當(dāng)被測(cè)物的TLC行為不清時(shí)也可以測(cè)定。1988年，王健偉研究建立了不需水解的薄層色譜（TLC）分析方法用于TTX的定量檢測(cè)。采用火焰離子檢測(cè)器，不需將TTX降解為C9堿，避免了衍生反應(yīng)過(guò)程中可能存在的干擾。

醫(yī)學(xué)作用

河鲀毒素的顯著作用之一是產(chǎn)生嚴(yán)重的低血壓，5×10-4μg·g-1就可產(chǎn)生降壓作用。Kao等的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在α和β腎上腺素受體阻斷劑存在時(shí)，TTX具有血管舒張作用。TTX使血管逐漸麻痹，外周血管阻力減小，造成血壓下降。在培養(yǎng)的牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，TTX尚可抑制腎上腺細(xì)胞釋放兒茶酚胺。盡管腹腔注射極微量TTX（4×10-4μg·g-1）不影響猴的收縮壓和舒張壓，當(dāng)微量的TTX與心得安合用時(shí)可短時(shí)降低舒張壓；與戊脈安合用時(shí)能降低收縮壓和舒張壓。國(guó)產(chǎn)河鲀毒素0.05×10-3~2.0×10-3μg·g-1給家兔靜脈注射、0.5×10-3~2.0×10-3μg·g-1給大鼠靜脈注射均能產(chǎn)生降壓作用。離體血管及離體心臟實(shí)驗(yàn)證明，TTX無(wú)直接擴(kuò)張血管作用，但可明顯抑制心臟，推測(cè)河鲀毒素的降壓作用與抑制心臟作用有關(guān)。

河鲀毒素中毒所致昏迷患者中有“假性昏迷”的存在。假性昏迷的原因推測(cè)為：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)肌肉接頭處被阻滯，出現(xiàn)四肢癱瘓、腱反射消失、壓眶反射消失及周?chē)院粑÷楸裕徊糠帜X干受抑制，而大腦皮質(zhì)未受到完全抑制，導(dǎo)致四肢癱瘓、血管運(yùn)動(dòng)中樞和呼吸中樞麻痹。確切機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

由于河毒素獨(dú)特的作用機(jī)制，使人們對(duì)其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了濃厚興趣。因此，通過(guò)對(duì)毒素分子母核的研究，有可能人工合成一系列控制神經(jīng)肌肉細(xì)胞膜作用機(jī)制的藥物。臨床上，河毒素針劑可以代替嗎啡、杜冷丁、阿托平和南美筒箭毒等，用于治療神經(jīng)痛，鎮(zhèn)痛的時(shí)間可達(dá)12-20h。河毒素的毒性較大，在使用上受到一定限制，但在臨床上可有以下幾方面的用途：（1）鎮(zhèn)痛，含TTX的注射劑曾用于治療神經(jīng)痛、癌痛、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛、麻瘋痛以及因創(chuàng)傷、挫傷、燒傷引起的疼痛。（2）局部麻醉，由于河毒素的麻醉作用比一般的局部麻醉藥要強(qiáng)上萬(wàn)倍，故國(guó)外已有河毒素與普通麻醉藥配伍而作為麻醉藥的專(zhuān)利出售。（3）鎮(zhèn)靜，可用作瘙癢鎮(zhèn)靜劑，對(duì)于皮膚瘙癢癥、疥癬、皮炎等可以止癢，進(jìn)而促使其痊愈。也可用作呼吸鎮(zhèn)靜劑，治療氣喘和百日咳等癥。（4）鎮(zhèn)痙，作為解痙劑，用于松弛肌肉痙攣、胃痙攣和其它痙攣，對(duì)破傷風(fēng)痙攣的解痙效果尤為顯著。（5）降壓，河毒素有獨(dú)特的降血壓效果可以考慮在臨床上用來(lái)?yè)尵雀哐獕夯颊?。?）抗心律失常，河毒素有明顯的抗心律失?；钚?，若與其他抗心律失常藥物配用，可顯著增強(qiáng)對(duì)心律失常的療效。（7）其它，作尿意鎮(zhèn)靜劑，用于遺尿癥的治療，對(duì)男性陽(yáng)痿及婦女性欲缺乏癥等也有一定的療效。

神經(jīng)生物學(xué)家證實(shí)微量毒液就有治療作用。河鲀毒素也可作為局部麻醉藥，其局部麻醉作用比一般麻藥強(qiáng)。國(guó)外已有將河鲀毒素與普通麻藥配伍作為局部麻藥的專(zhuān)利出售。河鲀毒素對(duì)癌痛的鎮(zhèn)痛也很有效。研究人員發(fā)現(xiàn)癌癥病人24h持續(xù)杜冷丁治療收效甚微，而注射河鲀毒素，每天2次，連續(xù)3天疼痛便緩解。河鲀毒素不僅可以有效緩解晚期癌癥引起的劇烈痛楚，還可治療頑固性哮喘等。中國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，河鲀毒素還是一種戒毒良藥。研究人員對(duì)吸毒者進(jìn)行試驗(yàn)，在注射極微量的河鲀毒素后，所有各種“戒毒綜合癥”在30 min后全部消失。連續(xù)注射5 d后可完全戒除毒癮，且沒(méi)有副作用。1998年，加拿大國(guó)際韋克斯技術(shù)公司利用河鲀毒素成功研制成一種名為tetrodin的戒毒新藥。利用河鲀毒素來(lái)戒除毒癮，可謂“以毒攻毒”的一大創(chuàng)舉。

限制河毒素成為藥物的最大問(wèn)題在于有效劑量與有毒劑量十分接近，臨床用藥方面的應(yīng)用應(yīng)以降低毒性為前提。因此如采用化學(xué)合成、修飾技術(shù)，對(duì)TTX進(jìn)行改構(gòu)，特異性地增強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用而降低毒性，則能推動(dòng)河毒素的商品化進(jìn)程。

河鲀毒素是特異性強(qiáng)的Na 通道阻斷劑。當(dāng)其位于膜外側(cè)與鈉離子通道受體部位Ⅰ結(jié)合，能阻止鈉離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而阻斷電壓依賴(lài)性鈉通道，影響細(xì)胞膜動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，阻滯動(dòng)作電位，抑制與之相關(guān)的生理活動(dòng)。研究表明，河鲀毒素對(duì)Na 通道的影響可能是其鎮(zhèn)痛的機(jī)制。 

中樞性鎮(zhèn)痛藥嗎啡對(duì)各種疼痛均有強(qiáng)大的抑制作用，但因?qū)χ菀桩a(chǎn)生耐受性和成癮性而不能廣泛和連續(xù)使用，而河鲀毒素對(duì)多種鈍痛及銳痛均有緩解作用，且不會(huì)對(duì)之產(chǎn)生依賴(lài)性，可減輕晚期癌癥患者的疼痛。單獨(dú)使用河鲀毒素也具有一定鎮(zhèn)痛作用，能夠抑制甲醛引起的炎癥性疼痛和水腫；河鲀毒素與茚蟲(chóng)威聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同鎮(zhèn)痛抗炎作用，在早期兩者聯(lián)合使用，其鎮(zhèn)痛強(qiáng)度與嗎啡相差不多，在晚期給藥作用極其顯著，鎮(zhèn)痛強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)嗎啡；小劑量河鲀毒素和阿司匹林聯(lián)合使用能明顯提高鎮(zhèn)痛療效。河鲀毒素也具有很強(qiáng)的局部麻醉作用，其效力比常用局麻藥強(qiáng)千倍以上，持續(xù)時(shí)間也明顯延長(zhǎng)；河鲀毒素具有鎮(zhèn)痛作用，用醋酸刺激引起小鼠腹膜炎癥而產(chǎn)生疼痛，表現(xiàn)為扭體反應(yīng)。微量河鲀毒素或者微量河鲀毒素聯(lián)合小劑量的戊巴比妥鈉注射到小鼠體內(nèi)后，小鼠扭體的頻率降低。河鲀毒素對(duì)器官的缺血性損傷具有保護(hù)作用，可明顯降低腦梗死的體積及神經(jīng)功能缺失的癥狀。河鲀毒素對(duì)常規(guī)心律失常具有較好的拮抗作用，特別是在抗室顫方面效果顯著。但是以上實(shí)驗(yàn)均是在小鼠或兔子身上做的，還沒(méi)有應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)上。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，河鲀毒素對(duì)嗎啡戒斷反應(yīng)具有明顯的抑制作用，可以用作阿片類(lèi)毒品的戒毒藥物。加拿大科學(xué)家已經(jīng)將其應(yīng)用于臨床，效果比較顯著。另外，河鲀毒素在治療癌癥、延緩衰老和提高免疫力等方面也取得了顯著的成效。

臨床上若使用河鲀毒素劑量過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)端神經(jīng)受損，而神經(jīng)損害可累及神經(jīng)根、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)。因此，為了避免河鲀毒素在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生全身毒性反應(yīng)，已研制出河鲀毒素微膠囊，將其分散地移植到坐骨神經(jīng)的細(xì)胞膜下，既能起到局部麻醉的作用，又能降低對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。河鲀毒素微膠囊的研發(fā)成功，可以使河鲀毒素在臨床上得到廣泛應(yīng)用。河鲀毒素與神經(jīng)變性有關(guān)。用河鲀毒素處理神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致692個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)發(fā)生異常。因此，河鲀毒素作為一種神經(jīng)毒素，為研究基因的表達(dá)規(guī)律及神經(jīng)衰退機(jī)制提供了一條新途徑。另外，河鲀毒素還可治療與睡眠相關(guān)的疾病。在網(wǎng)狀腦橋嘴核和藍(lán)斑下核內(nèi)微量注射河鲀毒素，它們的活性受到抑制，導(dǎo)致快速眼動(dòng)睡眠時(shí)間和非快速眼動(dòng)睡眠時(shí)間減少，證明河鲀毒素能降低腦橋區(qū)的活性，影響生物的睡眠—覺(jué)醒狀態(tài)。

預(yù)防與救治

河鲀魚(yú)營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，有長(zhǎng)江第一鮮之稱(chēng)。河鲀魚(yú)的食用在中國(guó)、日本等亞洲國(guó)家有著悠久的歷史，并逐漸形成特有的河鲀飲食文化。日本還將河鲀宴視作國(guó)宴，招待貴賓。然而，即使對(duì)河鲀烹調(diào)人員進(jìn)行專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，飯店得到衛(wèi)生部門(mén)許可及實(shí)施特許經(jīng)營(yíng)，如加工處理不當(dāng)，還會(huì)引起食物中毒及致殘致死事故，嚴(yán)重威脅人們的生命安全。統(tǒng)計(jì)在1972-1993年間，僅日本發(fā)生河鲀中毒者就達(dá)1258人，致死279人之多。中國(guó)河鲀中毒事件較多，最高為1993年，死亡147人。

河豚毒素對(duì)熱穩(wěn)定，于100℃處理24h或120℃處理20-60min方可使毒素完全破壞。中國(guó)古書(shū)曾記載“河豚出于江海，有大毒，能殺人。”明代黃省曾的《魚(yú)經(jīng)》云：“凡烹調(diào)者，腹之子、目之精、脊之血必盡棄之。”“凡洗宜極凈，煮宜極熟，治之不中度，不熟則毒于人?！边@說(shuō)明在烹調(diào)過(guò)程中河豚毒素是很難除去。因此：加強(qiáng)河豚魚(yú)知識(shí)宣傳，了解毒性，避免誤食或貪其美味但處理不當(dāng)而中毒；對(duì)于某些毒性較小的河豚魚(yú)品種應(yīng)在專(zhuān)門(mén)單位由有經(jīng)驗(yàn)的人進(jìn)行加工處理之后制成罐頭或干制品用于食用。

由于河豚毒素在極低濃度即可阻塞Na 通道，使河豚魚(yú)中毒潛伏期縮短，絕大多數(shù)在食用后10~45 min發(fā)病，病情發(fā)展迅速，先是皮膚有麻或刺痛感，很快延及手指、四肢及其它部位，產(chǎn)生廣泛的肌肉麻痹；消化系統(tǒng)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉，嚴(yán)重者可致呼吸肌麻痹、血壓下降、循環(huán)衰竭。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)特效解毒劑，一般采用綜合對(duì)癥治療措施，如早期服用1%硫酸銅100 mL催吐；用1:5 000高錳酸鉀或0.2%活性炭懸浮液洗胃；靜脈注射高滲或等滲葡萄糖溶液，以促進(jìn)毒素的盡快排泄；維持呼吸；解毒，莨菪類(lèi)藥物包括阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿、樟柳堿等大劑量應(yīng)用對(duì)救治河豚魚(yú)類(lèi)中毒有顯著效果；肌肉麻痹者可肌注1%鹽酸士的寧2ml及維生素B2、B6去麻痹，咖啡因、山梗烷醇酮和硫代硫酸鈉與生理鹽水一起靜脈注射也有顯著療效。同時(shí)可采取補(bǔ)液等對(duì)癥治療措施。

自1990年《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理辦法》頒布以來(lái)，中國(guó)的法律規(guī)定就禁止食用鮮河鲀，這是基于生長(zhǎng)在深海的劇毒河鲀魚(yú)肌肉有毒而作出的防范規(guī)定。江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T 543-2002“無(wú)公害家化暗紋東方鲀安全加工操作規(guī)范”規(guī)定該品種的肌肉TTX含量不應(yīng)超過(guò)10MU/g，而其余部位包括卵巢、肝臟、脾、腎、血液、眼球、膽、胃、腸、心臟、腮均作為有毒廢棄物處理。